一文帶你讀懂蛋白質(zhì)測定標準的五種方法

蛋白質(zhì)測定標準是一款智能化的氮與蛋白質(zhì)含量分析儀器，采用內置計算機控制，自動(dòng)化完成蒸餾過(guò)程，大屏觸摸設置參數，只需輕輕推至取放硝化管把手，安全把手硝化管置于工作部位，關(guān)閉亞克力安全門(mén)，自動(dòng)完成加水、加堿與蒸餾，工作完成后自動(dòng)關(guān)機并鳴音提示。

蛋白質(zhì)測定標準主要有五種方法,分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法和酚試劑法

1.凱氏定氮法：

蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解,產(chǎn)生的氨與硫酸結合生成硫酸銨,留在消化液中,然后加堿蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后,再用鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量來(lái)乘以蛋白質(zhì)換算系數,即得蛋白質(zhì)含量。因為食品中除蛋白質(zhì)外,還含有其它含氮物質(zhì),所以此蛋白質(zhì)稱(chēng)為粗蛋白。

2.雙縮脲定氮法：

在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò )合物,稱(chēng)為雙縮脲反應。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵,這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應。紫色絡(luò )合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān),故可用來(lái)測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有:硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

3.紫外吸收定氮法：

蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。形成顏色產(chǎn)物的量取決于蛋白質(zhì)的濃度。實(shí)際測定時(shí),必須預先用標準蛋白質(zhì)溶液制作一個(gè)標準校正曲線(xiàn),通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白質(zhì)標準溶液。

不同濃度的標準蛋白質(zhì)溶液加入雙縮脲試劑后,反應生成的顏色產(chǎn)物用紫外-可見(jiàn)分光光度計在540nm 波長(cháng)下測定吸光度,以雙縮脲試劑加緩沖或水作空白對照。然后將測得的值分別對蛋白濃度(mg/ ml) 作圖,得標準曲線(xiàn)。

未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理,根據測得吸光度值在標準曲線(xiàn)上直接查得未知蛋白質(zhì)樣品中得蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí),由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時(shí)的pH要與測定標準曲線(xiàn)的pH相一致。

4.酚試劑法：

此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin —酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應產(chǎn)生深藍色的原因是:

①在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結合生成復合物。

②Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深藍色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,藍色深度與蛋白的量成正比。